معلومة

11.6: النقل الحويصلي - علم الأحياء


بالإضافة إلى معالجة البروتين ، يهتم كل من ER و Golgi أيضًا ببعض أنواع نقل البروتين. تنفصل الحويصلات (الفقاعات المرتبطة بالغشاء ، بشكل أساسي) عن ER و Golgi وعضيات غشائية أخرى ، وتحمل معها أي جزيئات قابلة للذوبان كانت داخل السائل المغلق وكذلك أي جزيئات مدمجة في هذا الجزء من الغشاء. ثم تلتقط هذه الحويصلات على محرك جزيئي مثل كينيسين أو ميوسين ، وتنتقل على طول الهيكل الخلوي حتى ترسو في الوجهة المناسبة وتندمج مع الغشاء أو العضية المستهدفة. بشكل عام ، تنتقل الحويصلات من ER إلى رابطة الدول المستقلة جولجي ، ومن رابطة الدول المستقلة إلى جولجي الإنسي ، ومن الوسط إلى جولجي العابر ، ومن جولجي العابر إلى غشاء البلازما أو الأجزاء الأخرى. على الرغم من أن معظم الحركة في هذا الاتجاه ، إلا أن هناك أيضًا حويصلات تعود من جولجي إلى ER ، وتحمل البروتينات التي كان من المفترض أن تبقى في ER (مثل PDI) وتم التقاطها عن طريق الخطأ داخل الحويصلة.

يعتمد تكوين الحويصلات على بروتينات الغلاف التي ستتجمع ذاتيًا في أقفاص كروية في ظل ظروف مناسبة. عند ارتباطها ببروتينات الغشاء ، يمكنها أيضًا سحب الغشاء المتصل إلى شكل كروي. الأنواع الرئيسية لبروتينات الغلاف المستخدمة في تكوين الحويصلة هي COPII و COPI و clathrin.

تشكل بروتينات غلاف COPII الحويصلات التي تنتقل من ER إلى Golgi. تُستخدم بروتينات طبقة COPI بين أجزاء جهاز Golgi وكذلك لتشكيل حويصلات تنتقل من Golgi إلى ER. أخيرًا ، يستخدم الكلاذرين لتشكيل حويصلات تغادر جولجي لغشاء البلازما وكذلك للحويصلات المتكونة من غشاء البلازما من أجل الالتقام الخلوي.

Clathrin (الشكل ( PageIndex {17} )) هو أفضل وصف من بين الثلاثة ، والمعاطف الحويصليّة مصنوعة من ترتيبات من triskelions الكلاذرين (من اليونانية ، بمعنى ثلاثي الأرجل). يتكون كل triskelion من ثلاث سلاسل ثقيلة مرتبطة معًا عند الطرف C ، وثلاث سلاسل خفيفة ، واحدة مرتبطة بكل سلسلة ثقيلة. تتفاعل السلاسل الثقيلة من triskelions المختلفة على طول "أرجل" السلسلة الثقيلة لتكوين بنية قوية للغاية. سلاسل الضوء غير ضرورية لتكوين الحويصلة ، ويُعتقد أنها تساعد في منع التفاعلات العرضية لجزيئات الكلاذرين في السيتوبلازم.

يوجد تشابه كبير بين آليات تكوين الحويصلة باستخدام بروتينات الغلاف المختلفة هذه ، بدءًا من توظيف ARF1 (يرمز ARF إلى عامل الارتباط بالريبوزيل ADP ، والذي لا علاقة له بوظيفته هنا) للغشاء. وهذا يتطلب التبادل الميسر من ARNO لـ GTP للناتج المحلي الإجمالي (ARNO هو فتاحة موقع ربط نوكليوتيد ARF). بمجرد ربط ARF1 بـ GTP ، يكشف التغيير التوافقي عن مجموعة N-terminal myristoyl التي يتم إدراجها في الغشاء. تستخدم كل من الحويصلات المطلية بالـ COPI والكلاترين ARF1 و ARNO ، لكن COPII يستخدم بروتينات مماثلة تسمى Sar1p و Sec12p.


الشكل ( PageIndex {18} ). حويصلات مغلفة بـ COP

يتم استخدام ARF1 (أو Sar1p) لتجنيد البروتينات المحولة التي ترتبط بالطرف "الذيل" لبروتينات المستقبل المرتبطة بالغشاء. ترتبط نهاية عمل هذه المستقبلات بجزيئات الانتقال التي تحتاج إلى حزم في الحويصلة. تعمل بروتينات المهايئ كحلقة وصل بين الغشاء (من خلال المستقبلات) وبروتينات الغلاف. بالنسبة إلى الكلاذرين ، فإن بروتينات المحول هي AP1 للحويصلات المشتقة عبر Golgi و AP2 للحويصلات الداخلية. بالنسبة لحويصلات COPI ، فإن المتجانسات التقريبية هي β- و γ- و δ- و ζ- COP بينما يستخدم نظام COPII Sec23p و Sec24p.

أخيرًا ، ترتبط المحولات ببروتينات الغلاف الفعلية: clathrin و α- أو ε- COP و Sec13p و Sec31p. ما تشترك فيه هذه البروتينات جميعًا هو أنها تلقائيًا (أي دون الحاجة إلى إنفاق الطاقة) ، تتجمع ذاتيًا في هياكل كروية تشبه القفص. تحت المجهر الإلكتروني ، يتم تحديد الحويصلات المطلية بالكاذرين بشكل أكثر حدة والأشكال السداسية والخماسية التي تحدها وحدات الكلاذرين الفرعية تعطي الحويصلة شكل "كرة القدم". الحويصلات المطلية بطبقة COP أكثر ضبابية في المظهر تحت EM.

تتمتع جميع الأنواع الثلاثة من بروتينات غلاف الحويصلة بالقدرة على الارتباط تلقائيًا في بنية كروية ، ولكن فقط الحويصلة المطلية بـ COPI و COPII هي أيضًا "تضغط" تلقائيًا على الغشاء لتحرير الحويصلة من غشاءها الأصلي. تتطلب الحويصلات المطلية بالكالذرين آلية خارجية لتحرير الحويصلة (الشكل ( PageIndex {19} )).

بمجرد اكتمال الحويصلة تقريبًا ، لا يزال هناك ساق صغير أو عنق غشاء يربط الحويصلة بالغشاء. حول هذا القصبة ، تتجمع جزيئات GTP الديناميكية في بنية حلزونية / حلزونية. جزيئات الدينامين هي عبارة عن قواعد جي بيانية كروية تتقلص عند التحلل المائي لـ GTP. عندما يرتبطون حول ساق الحويصلة ، يتقلص كل بروتين دينامين ، مع التأثير المشترك لتضييق الساق بدرجة كافية بحيث يقرص الغشاء معًا ، ويغلق ويطلق الحويصلة من الغشاء الأصلي.

على الرغم من مناقشة الدهون والأغشية في الفصل 4 ، فقد أهملنا مناقشة موقع توليفاتها في حقيقيات النوى. كما يشير الشكل ( PageIndex {20} ) ، يتم فصل تركيب أنواع معينة من الدهون وحصريًا. تتشكل الجلسيروفوسفوليبيدات بشكل أساسي في الشبكة الإندوبلازمية ، على الرغم من أنها مصنوعة أيضًا في الميتوكوندريا والبيروكسيسومات. في المقابل ، لا يتم تصنيع الشحميات السفينجولية في ER (على الرغم من وجود سلائف سيراميد) في الثدييات ، توجد الإنزيمات اللازمة في تجويف رابطة الدول المستقلة والجولجي الإنسي. هناك دليل على حركة حويصلية متقادمة وعكسية بين مقصورات Golgi و ER ، والتي من شأنها أن تشير نظريًا إلى إعادة توزيع أنواع الدهون. ومع ذلك ، تميل الشحميات السفينجولية إلى التجمع في طوافات دهنية ويبدو أنها أكثر تركيزًا في الحويصلات التي تتحرك بالتدريج.

بروتينات الغلاف تؤتي ثمارها بعد فترة وجيزة من الإطلاق الحويصلي. بالنسبة للكلاثرين ، تتضمن العملية Hsc70 ، وهو ATPase. ومع ذلك ، بالنسبة للحويصلات المطلية بـ COPI أو COPII ، يبدو أن التحلل المائي لـ GTP على ARF / Sar1p يضعف تقارب بروتين الغلاف للمحولات ويبدأ في فك الطلاء. المنشط GTPase هو ARF GAP (أو Sec23p) وهو جزء لا يتجزأ من طبقة COP I (أو II).

تحمل الحويصلات فئتين من البضائع: البروتينات القابلة للذوبان وبروتينات الغشاء. من البروتينات القابلة للذوبان ، يتم تناول بعضها في الحويصلة بحكم ارتباطها بمستقبل. تصادف وجود بروتينات أخرى في الجوار ويتم التقاطها مع تشكل الحويصلة. من حين لآخر ، يتم تناول بروتين لم يكن من المفترض أن يكون ؛ على سبيل المثال ، قد يتم وضع PDI في حويصلة تتشكل من ER. لها وظيفة قليلة في Golgi ، وهي مطلوبة في غرفة الطوارئ ، فماذا يحدث لها؟ لحسن الحظ ، يحتوي PDI والعديد من بروتينات ER الأخرى على تسلسل إشارة C- طرفي ، KDEL (ليسين - حمض الأسبارتيك - حمض الجلوتاميك - ليوسين) ، الذي يصرخ "أنا أنتمي إلى ER." يتم التعرف على هذا التسلسل بواسطة مستقبلات KDEL داخل Golgi ، ويؤدي ارتباط بروتينات KDEL بالمستقبلات إلى تكوين الحويصلة لإرسالها مرة أخرى إلى ER.

الحويصلات الإفرازية لها مشكلة خاصة مع البضائع القابلة للذوبان. إذا كانت الحويصلة تعتمد ببساطة على إحاطة البروتينات بداخلها أثناء عملية التكوين ، فسيكون من الصعب الحصول على تركيزات عالية من تلك البروتينات. يحتاج الكائن الحي إلى العديد من البروتينات المفرزة بسرعة وبكميات كبيرة ، لذلك توجد آلية في ترانس جولجي لتجميع البروتينات الإفرازية. تستخدم الآلية بروتينات مجمعة مثل secretogranin II و chromogranin B التي تجمع البروتينات المستهدفة في حبيبات كبيرة مركزة. تعمل هذه الحبيبات بشكل أفضل في بيئة Golgi ذات الأس الهيدروجيني المنخفض والكالسيوم المرتفع2+، لذلك عندما تطلق الحويصلة محتوياتها خارج الخلية ، يرتفع الرقم الهيدروجيني وينخفض ​​الكالسيوم2+ يكسر الركام لتحرير البروتينات الفردية.

هناك تغيير ثابت في الرقم الهيدروجيني أثناء نضوج جهاز جولجي ، بحيث عندما ننتقل من ER إلى Golgi ، يكون لكل جزء درجة حموضة تجويف أقل (أكثر حمضية) بشكل تدريجي.

أخيرًا ، هناك مسألة استهداف الحويصلات. تكون الحويصلات أقل فائدة بكثير إذا تم رميها في قطار شحن جزيئي وسقطت عشوائيًا. لذلك ، هناك آلية لرسو السفن تتطلب مطابقة بروتين v-SNARE على السطح السيتوبلازمي للحويصلة و t-SNARE على السطح السيتوبلازمي للغشاء المستهدف. يستمر اندماج الحويصلة في الغشاء فقط إذا كان هناك تطابق. خلاف ذلك ، لا يمكن أن تندمج الحويصلة ، وسوف تلتصق بمحرك جزيئي آخر لتتجه إلى وجهة أخرى ، نأمل أن تكون صحيحة. يتم المساعدة في هذه العملية عن طريق ربط البروتينات التي تقوم في البداية بالاتصال بحويصلة واردة وتقريبها بدرجة كافية من الهدف لاختبار تفاعل بروتين SNARE. تتفاعل البروتينات الأخرى الموجودة على الحويصلة والأغشية المستهدفة ، وإذا تطابق SNAREs ، فيمكن أن تساعد في "رفع" الحويصلة إلى الغشاء المستهدف ، وعندها تندمج الأغشية. من القواعد المهمة لفهم الاندماج الحويصلي واتجاه بروتينات الغشاء والدهون ، أن الجانب المواجه للسيتوبلازم من الغشاء سيواجه دائمًا السيتوبلازم. لذلك ، سيتم إدخال البروتين الذي تم العثور عليه في النهاية على السطح الخارجي لغشاء الخلية في السطح اللمعي لغشاء ER لتبدأ به.

وبشكل أكثر تحديدًا ، عندما تقترب الحويصلة من الغشاء المستهدف ، فإن بروتين الربط Rab-GTP ، المرتبط بالغشاء المستهدف عبر ذيل شحمي geranylgeranyl مزدوج ، يرتبط بشكل فضفاض بالحويصلة ويحملها بالقرب من الغشاء المستهدف لإعطاء SNARES فرصة للعمل. تتاح الآن لـ v-SNAREs و t-SNAREs الفرصة للتفاعل واختبار المباراة. في الآونة الأخيرة ، تم تغيير اسم SNAREs إلى R-SNAREs و Q-SNAREs ، على التوالي ، بناءً على بقايا الأرجينين والجلوتامين المحفوظة. بالإضافة إلى هذين SNAREs الأساسيين ، يتم تضمين SNARE واحد آخر على الأقل ، ويشكل معًا حزمة من أربعة حلزونات α (أربعة ، وليس ثلاثة ، لأنه على الأقل في أفضل مثال تمت دراسته ، يكون أحد SNAREs عازمًا بحيث يكون اثنان من مجالاتها الحلزونية ألفا تشارك في التفاعل ، حيث تلتف الحلزونات الأربعة حول بعضها البعض ويعتقد أنها أثناء قيامها بذلك ، فإنها تسحب الحويصلة والغشاء المستهدف معًا.

ذيفان الكزاز ، التيتانوسبازمين ، الذي يفرزه كلوستريديوم الكزازية البكتيريا ، تسبب تشنجات من خلال العمل على الخلايا العصبية ، ومنع إطلاق الناقل العصبي. وتتمثل آلية ذلك في أنه يشق synaptobrevin ، وهو بروتين SNARE ، بحيث لا تندمج الحويصلات المشبكية مع غشاء الخلية. توكسين البوتولينوم ، من كلوستريديوم البوتولينوم، يعمل أيضًا على SNAREs لمنع اندماج الحويصلة وإطلاق الناقلات العصبية ، على الرغم من أنه يستهدف خلايا عصبية مختلفة وبالتالي له تأثير معاكس: يحدث الكزاز عن طريق منع إطلاق النواقل العصبية المثبطة ، بينما يحدث التسمم الغذائي عن طريق منع إطلاق النواقل العصبية المثيرة.


نقل الحويصلات v-SNARE 11

& ltp> توفر درجة التعليق التوضيحي مقياسًا إرشاديًا لمحتوى التعليق التوضيحي لإدخال أو بروتيوم UniProtKB. هذه الدرجة & ltstrong> لا يمكن & lt / strong> استخدامها كمقياس لدقة التعليق التوضيحي حيث لا يمكننا تحديد "التعليق التوضيحي الصحيح" لأي بروتين معين. & ltp> & lta href = '/ help / annotation_score' target = '_ top'> أكثر. & lt / a> & lt / p> - دليل تجريبي على مستوى البروتين i & ltp> يشير هذا إلى نوع الدليل الذي يدعم وجود البروتين. لاحظ أن دليل "وجود البروتين" لا يعطي معلومات عن دقة أو صحة التسلسل (التسلسلات) المعروضة. & ltp> & lta href = '/ help / protein_existance' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p>

حدد قسم على اليسار لرؤية المحتوى.


يتوسط النقل الحويصلي امتصاص البروتينات السيتوبلازمية في الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة السوداء

شيخوخة الميتوكوندريا ، التي تؤدي إلى خلل وظيفي في الميتوكوندريا ، ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالعديد من الأمراض المرتبطة بالعمر. ترتبط الشيخوخة بتضخم الميتوكوندريا ونقل بروتينات العصارة الخلوية إلى الميتوكوندريا. لا تزال آليات الاستتباب الأساسية التي تنظم مورفولوجيا ووظيفة الميتوكوندريا ، وانهيارها أثناء الشيخوخة ، غير واضحة. هنا ، نحدد مسار تهريب بروتين الميتوكوندريا في Drosophila melanogaster الذي يتضمن بروتين Dosmit المرتبط بالميتوكوندريا. يستحث دوسميت تضخم الميتوكوندريا وتشكيل حويصلات مزدوجة الغشاء تحتوي على بروتين عصاري خلوي داخل الميتوكوندريا. يزيد معدل تكوين الحويصلة مع تقدم العمر. تنشأ الحويصلات من غشاء الميتوكوندريا الخارجي كما لوحظ من خلال تتبع توطين Tom20 ، ويتم التوسط في العملية بواسطة بروتين Rab32 المرتبط بالميتوكوندريا. يرتبط مستوى تعبير دوسميت ارتباطًا وثيقًا بمعدل تراكم البروتين في كل مكان ، والذي يرتبط بحد ذاته بالأمراض المرتبطة بالعمر. يقدم طريق تهريب بروتين الميتوكوندريا بوساطة دوسميت هدفًا واعدًا لعلاجات أمراض الميتوكوندريا المرتبطة بالعمر في المستقبل.

بيان تضارب المصالح

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

الأرقام

الشكل 1. حجم الميتوكوندريا ومعدل ...

الشكل 1. يزداد حجم الميتوكوندريا ومعدل تكوين الحويصلة داخل الغشاء المزدوج الغشاء مع تقدم العمر.

التين. 2. التخلص من البروتين المرتبط بالميتوكوندريا ، ...

الشكل 2. التخلص من بروتين دوسميت المرتبط بالميتوكوندريا يؤدي إلى اختلافات كبيرة في حجم الميتوكوندريا ...

الشكل 3. زيادة مستويات التعبير عن بروتين دوسميت ...

الشكل 3. تزيد مستويات التعبير البروتيني لدوسميت في الذباب البري طوال فترة الشيخوخة الطبيعية.

الشكل 4. تضخم وتشكيل الميتوكوندريا المستحثة بدوسميت ...

الشكل 4. تضخم الميتوكوندريا الذي يسببه دوسميت وتشكيل حويصلات داخل الميتوكوندريا في اليرقات والذباب البالغ.

الشكل 5. يستحث التعبير خارج الرحم لدوسميت ...

الشكل 5. يؤدي التعبير خارج الرحم لدوسميت إلى تكوين حويصلات داخل الميتوكوندريا تحتوي على بروتينات عصارية خلوية.

تم استيعاب 15 ٪ من GFP العصاري الخلوي في الميتوكوندريا عندما تم التعبير عن Dosmit (Dsm) خارج الرحم. ن = 2. ه توطين GFP المسمى بالذهب داخل الحويصلات داخل الميتوكوندريا لعضلات الطيران من الذباب الذي يعبر عن Dosmit (Mef2 & GT دوسميت + GFP، رؤوس الأسهم) ومن الميتوكوندريا لعضلات الطيران التي تعبر عن GFP بدون تعبير خارج الرحم لدوسميت (Mef2 & GT GFP) والتحكم في الميتوكوندريا (Mef2 / +). لوحات الألوان عبارة عن صور مجهرية متحد البؤر لوحات ذات مقياس رمادي هي صور TEM. أشرطة النطاق: 0.5 ميكرومتر. F GFP - جزيئات الذهب المترجمة داخل وخارج الحويصلات داخل الميتوكوندريا في العضلات من الذباب الذي يعبر عن Dosmit (Mef2 & GT دوسميت + GFP). ن = 7 و 7 من أشرطة اليسار إلى اليمين (يعني ± SD). اختبار إحصائي: مان ويتني ذات الذيلتين ش-اختبار. (***ص & lt 0.001). ز التصوير ثلاثي الأبعاد Mef2 & GT دوسميت + GFP يطير الميتوكوندريا ، مع استبطان GFP عصاري خلوي في الميتوكوندريا. يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

الشكل 6. يستحث التعبير خارج الرحم لدوسميت ...

الشكل 6. يؤدي التعبير خارج الرحم لدوسميت إلى تكوين حويصلات داخل الميتوكوندريا تحتوي على Tom20.

الشكل 7. تظهر الميتوكوندريا المسنة استيعاب ...

الشكل 7. تظهر الميتوكوندريا المسنة استيعاب محتوى العصارة الخلوية ، ولكن لا تظهر حويصلات في الشيخوخة ...

التين. 8. البروتين المرتبط بالميتوكوندريا ، Rab32 ، مكوّن ...

التين. 8. البروتين المرتبط بالميتوكوندريا ، Rab32 ، المتحول مع Tom20-HA ويخضع لتفاعل بروتين-بروتين مع ...

الشكل 9. تعريب Rab32 و Dosmit على ...

الشكل 9. توطين Rab32 و Dosmit على الميتوكوندريا يعتمد بشكل متبادل.

الشكل 10. يتوسط بروتين Rab32 المرتبط بالميتوكوندريا ...

الشكل 10. البروتين المرتبط بالميتوكوندريا Rab32 يتوسط في تضخم الميتوكوندريا الذي يسببه دوسميت.

الشكل 10. يتوسط بروتين Rab32 المرتبط بالميتوكوندريا ...

الشكل 10. البروتين المرتبط بالميتوكوندريا Rab32 يتوسط في تضخم الميتوكوندريا الذي يسببه دوسميت.


11.6: النقل الحويصلي - علم الأحياء

C2006 / F2402 '11 - مخطط تفصيلي للمحاضرة رقم 6

(ج) 2011 الدكتورة ديبورا موشوفيتز ، جامعة كولومبيا ، نيويورك ، نيويورك. اخر تحديث 02/06/2011 02:55 م

النشرات: 6 أ- نقل الجلوكوز عبر الجسم (gif) 6A - pdf
6B - RME (gif) 6B --RME (pdf)
6C - هيكل الشعيرات الدموية والشفاء أمبير
(تم النشر في الدورات الدراسية).
فيما يلي روابط لرسم تخطيطي لشعيرة دموية ، ومخطط لشفرة الخلايا ، وصورة مجهرية إلكترونية لشعيرة دموية.

1. الجمع بين كل طرق نقل الجزيئات الصغيرة أو ما هو جيد كل هذا؟

أ. كيف يحصل الجلوكوز من تجويف الأمعاء & # 8594 العضلات والخلايا الدهنية. مثال على كيفية استخدام أنواع النقل المختلفة. (المنشور رقم 6 أ) خطوات العملية:

1. كيف يخرج الجلوكوز التجويف. يعبر الجلوكوز السطح القمي للخلايا الظهارية بشكل أساسي عن طريق النقل المشترك للصوديوم / الجلوكوز. (2 س قانون النقل).

2. دور مضخة Na + / K +. تحافظ المضخة في السطح الجانبي السفلي (BL) على انخفاض الصوديوم في الخلية ، لذا يفضل Na + التدرج دخول الصوديوم. (1 س قانون النقل)

3. كيف يخرج الجلوكوز من الخلايا الظهارية.

أ. يخرج الجلوكوز (باستثناء ذلك المستخدم في عملية التمثيل الغذائي للخلية الظهارية) من سطح الخلية BL عن طريق الانتشار الميسر = النقل بوساطة الناقل.

ب. البروتين الناقل = GLUT2 (مزيد من التفاصيل حول عائلة البروتينات GLUT أدناه).

ج. عندما يترك الجلوكوز الخلايا يدخل السائل الخلالي = IF = سائل بين خلايا الجسم.

4. كيف يدخل الجلوكوز ويغادر الشعيرات الدموية - عن طريق الانتشار البسيط عبر الفراغات بين الخلايا. الخلايا المحيطة بالشعيرات الدموية في معظم الجسم هي ليسانضمت إليها تقاطعات ضيقة.

أ. لا تدخل المادة الشعيرات الدموية عن طريق الانتشار عبر الغشاء. تنتشر المادة من خلال السائل في الفراغات (المسام) بين الخلايا.

ب. لتكوين الشعيرات الدموية ، انظر النشرة 6C ، أسفل. (انظر أيضًا الروابط في بداية المحاضرة.) يتم توفير الصور في النشرة نظرًا لصعوبة فهم الوظيفة بدون علم التشريح. تُظهر الصورة كيف تحيط الخلايا البطانية بتجويف الشعيرات الدموية ، وتشكل مسامًا بين الخلايا. تسمح المسام بالانتشار (الجلوكوز والجزيئات المائية الصغيرة الأخرى ، ولكن ليس البروتينات) داخل وخارج الشعيرات الدموية.

ج. حاجز الدم في الدماغ: الخلايا الشعرية في الدماغ نكون متصلة بواسطة تقاطعات ضيقة - لا توجد مسام (مسافات بين الخلايا) لذلك لا يمكن للمادة أن تنتشر داخل وخارج الشعيرات الدموية في الدماغ. انقر هنا للحصول على تفاصيل حول BBB. (لمعلوماتك فقط).

5. كيف يدخل الجلوكوز خلايا الجسم

أ. يدخل الجلوكوز الخلايا عن طريق الانتشار الميسر = النقل بوساطة الناقل باستخدام بروتين GLUT.

ب. يكون الناقل بشكل دائم في غشاء الخلية في العديد من أنواع الخلايا (الدماغ والكبد).انظر أدناه على ناقلات GLUT.

ج. يتم إدخال الناقل (GLUT 4) فقط في الغشاء (عن طريق اندماج الحويصلات كما هو موضح سابقًا) في بعض أنواع الخلايا (العضلات الدهنية والأمبيرية) في وجود الأنسولين.

6. دور فسفرة الجلوكوز. يحبس تحويل G & # 8594 G-6-phosphate G داخل الخلايا.

للحصول على أمثلة إضافية لاستخدامات الأنواع المختلفة لعمليات النقل ، انظر شكل بيكر. 8-1 أمبير 8-2. للحصول على صور للخطوات 1-3 ، راجع http://www.biology.arizona.edu/cell_bio/problem_sets/membranes/graphics/cotransport_sys.gif أو

لاحظ أن كلاهما يأتي من فصول تحتوي على ملاحظات موسعة عبر الإنترنت. تتضمن دورة الكيمياء الحيوية العديد من الرسوم المتحركة لبروتينات النقل.

ب. كيف يصل الجلوكوز إلى خلايا الجسم - نظرة أخرى على النشرة 6-أ. تم وصف الخطوات في العملية أعلاه بالترتيب الذي تحدث به. فيما يلي ملخص مع التركيز على أنواع النقل المختلفة المعنية.

1. دور النقل النشط RT - مطلوب للحصول على الجلوكوز من التجويف إلى داخل الخلية الظهارية.

أ. النقل النشط الأساسي - تحافظ مضخة Na + / K + على انخفاض [Na +] داخل الخلايا.

ب. النقل النشط الثانوي - يدخل الجلوكوز الخلايا الظهارية عن طريق النقل المشترك للصوديوم / الجلوكوز

2. دور النقل السلبي & amp ؛ الفسفرة (للجلوكوز)

أ. النقل السلبي - يستخدم لنقل الجلوكوز إلى باقي الطريق - خارج الخلايا الظهارية ، داخل وخارج الشعيرات الدموية ، إلى خلايا الجسم.

ب. فسفرة الجلوكوز - يستخدم في خلايا الجسم للحفاظ على مستوى الجلوكوز الحر عند & quot ؛ نهاية الطريق & quot ؛ منخفضًا ، والتأكد من أن تدرج الجلوكوز هو & quot ؛ أسفل & quot ؛ من الخلايا الظهارية إلى الشعيرات الدموية إلى خلايا الجسم.

3. دور الانتشار: ينتشر الجلوكوز والجزيئات الصغيرة الأخرى (ولكن ليس الجزيئات الكبيرة) داخل وخارج الشعيرات الدموية من خلال الفراغات المملوءة بالسائل بين الخلايا ، ليس عن طريق الانتشار عبر غشاء الخلية.

معظم البروتينات أكبر من أن تدخل الشعيرات الدموية أو تتركها عن طريق الانتشار. تدخل معظم البروتينات وتغادر عن طريق الترانزيت الموضح في النشرة 6C والموضحة أدناه.

4. دور القنوات: لم يتم عرض أي منها في النشرة ، ولكن يمكن أن ينتقل الجلوكوز من خلية ظهارية إلى أخرى من خلال تقاطعات الفجوة.

5 . دور ناقلات GLUT (عائلة بروتين / جينات أخرى)

أ. بروتينات GLUT هي المسؤولة عن مبني للمجهول نقل الجلوكوز. الجميع مبني للمجهول يعتمد نقل الجلوكوز عبر الأغشية (أي بوساطة الناقل) على عائلة من البروتينات تسمى GLUT 1 ، GLUT 2 ، وما إلى ذلك (GLUT = جيسكر رransporters)

ب. يتم التعبير عن أفراد الأسرة المختلفين (الجينات والبروتينات) في أنواع مختلفة من الخلايا. يوجد بروتين GLUT 1 في غشاء البلازما في خلايا الدم الحمراء وأغلب الخلايا الأخرى ، وبروتين GLUT 2 على سطح BL من الخلايا الظهارية المعوية ، وبروتين GLUT 4 في الأنسجة العضلية والدهنية ، وما إلى ذلك (لاحظ أن جميع الجينات لجميع البروتينات موجودة في كل هذه الخلايا الأنواع - الحمض النووي هو نفسه!)

ج. جميع الجينات والبروتينات المقابلة متشابهة ، لكن لها اختلافات هيكلية ووظيفية كبيرة. هذا مثال آخر على عائلة الجينات / البروتين. جميع البروتينات لها بنية عامة متشابهة - 12 قطعة غشائية ، COOH ونهايات أمينية على الجانب داخل الخلايا من الغشاء ، إلخ. للحصول على صورة انقر هنا. للحصول على رسم تخطيطي وجدول ، انتقل إلى http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK30/box/A54/

د. موضع وعمل GLUT 4 يعتمد على الأنسولين. GLUT 4 هو العضو الوحيد المعتمد على الأنسولين في الأسرة. يؤدي الأنسولين إلى إدخال بروتين GLUT 4 في غشاء البلازما ، عن طريق تحفيز اندماج الحويصلة ، كما هو موضح سابقًا. توجد جميع البروتينات الأخرى بشكل أساسي في أغشية كل منها.

ه. اتجاه النقل. لاحظ أن أحد أفراد هذه العائلة (GLUT 2) هو المسؤول عن نقل الجلوكوز من الخلايا الظهارية ، والأعضاء المختلفون هم المسؤولون عن مساعدة الجلوكوز في دخول معظم الخلايا الأخرى. يربط جميع أفراد الأسرة الجلوكوز على جانب واحد من الغشاء ، ويغيرون الشكل ويطلقون الجلوكوز على الجانب الآخر من الغشاء. تعتمد الطريقة التي ينتقل بها الجلوكوز (للداخل أو للخارج) على التركيزات النسبية للجلوكوز على جانبي الغشاء المعني ، وليس على بروتين GLUT المستخدم. (انظر المشكلة 2-12 ج.)

F. بروتينات SGLT هي المسؤولة عن أكتيفه نقل الجلوكوز. (SGLT = سكراهية -glسكوز رransporters). تشكل بروتينات SGLT عائلة بروتين مختلفة. أفراد هذه العائلة مسؤولون عن نشيط نقل الجلوكوز عبر الأغشية. (انظر المشكلة 2R-2.)

ز. تتطلب كل عمليات نقل الجلوكوز داخل وخارج الخلايا بروتين نقل. يمكن أن يكون البروتين ناقلًا أو مضخة أو قناة. ينتقل في الشعيرات الدموية عن طريق الانتشار بين الخلايا ليس تتطلب ناقل بروتين.

جرب المشكلة 2-9 & amp 2-12.

ثانيًا. طرق دخول الجزيئات الكبيرة إلى الخلايا - أنواع الالتقام الخلوي. في جميع الحالات ، يكون التأثير الصافي هو أن غشاء الخلية ينثني ويقرص ، مكونًا حويصلة في السيتوبلازم تحتوي على مادة من الخارج.

أ. كثرة الخلايا = الالتقام الكتلي الطور بدون مستقبلات. تستوعب الخلايا عشوائي عينات من السائل المحيط تحتوي على مجموعة عشوائية من المواد خارج الخلية.

ب. البلعمة - في الخلايا المتخصصة فقط - تمد امتدادات الخلايا (pseudopods) المواد الصلبة وتبتلعها. انظر بيكر الشكل. 12-14. تسمى الحويصلة التي يتم تشكيلها الحويصلة البلعمية (أو فجوة) أو البلعمة. يتطلب MF.

ج. RME = الالتقام الخلوي بوساطة المستقبل. تستوعب الخلايا محدد المواد من السوائل المحيطة باستخدام مستقبلات. انظر بيكر الشكل. 12-15 (رسم بياني) و 12-16 أمبير (صورة مجهرية). أنواع الخلايا المختلفة لها مجموعات مختلفة من المستقبلات.


ثالثا. RME - الالتقام بوساطة المستقبلات

أ. ميزات عامة و / أو مهمة.

1. مستقبلات - تحتاج إلى مستقبل محدد لكل مادة (أو فئة من المواد وثيقة الصلة) ليتم نقلها د.

2. المركزات المواد المنقولة - تنقلها عادة فوق انحدارهم.

3. يتطلب طاقة - مراحل متعددة في العملية تستخدم ATP أو GTP. يجب أن تكون الطاقة مطلوبة لأن المواد تتحرك عكس انحدارها. الطاقة مطلوبة لتشكيل الحويصلات ومعالجة و / أو نقل الحويصلات داخل الخلية.

4. دور الكلاذرين - هناك حاجة إلى بروتين غشاء محيطي لتشويه الغشاء والسماح بتكوين الحويصلات - يوفر غلافًا. (انظر أشكال بيكر 12-15 إلى 2-18 و / أو شكل سادافا 6.19 (5.17) هناك حاجة لبروتينات أخرى أيضًا ، لكن لن تتم مناقشتها.

أ. Clathrin هو بروتين معطف للحويصلات المتكونة من غشاء البلازما و trans-Golgi *.

ب. تنبت أغشية أخرى تتضمن بروتينات مختلفة. أشهرها هي COPI & amp COPII اللتان تشاركان في نقل ER-Golgi. (انظر بيكر لمزيد من التفاصيل إذا كنت مهتمًا. تم تلخيص أنواع المعاطف في الجدول 12-2.)

* ملاحظة حول المصطلحات: الجانب العابر من Golgi = & quotfar end & quot = الجانب بعيدًا عن النواة و ER = الجزء الأخير الذي تنتقل إليه البروتينات أثناء معالجتها في Golgi. يُطلق عليه أيضًا & quotTGN & quot لشبكة & quottrans Golgi. & quot انظر Sadava fig. 5.11 (4.11) أو شكل بيكر. 12-8 للصور المسمى. مزيد من التفاصيل حول هيكل ووظيفة Golgi لاحقًا.

5. إنها دورة - خروج الخلايا يوازن الالتقام الخلوي بحيث تظل مساحة سطح الخلية كما هي. انظر شكل Sadava. 6.18 (5.16) أو شكل بيكر. 12-15. بالنسبة لمستقبل LDL ، تستغرق الرحلة حوالي 10-20 دقيقة. & quot

6. الطوبولوجيا - يمكن للمادة أن تدخل و / أو تخرج من الخلية دون ملامسة السيتوبلازم. يمكن أن تظل المادة داخل الحويصلة أو الخلية الخارجية في جميع الأوقات. (انظر Transcytosis.)

7. المصائر المحتملة للمواد الملقحة - أين الحويصلة تذهب؟ أين ينتهي المستقبل و / أو يجند؟

أ. انحلال - تتحلل الحويصلات مع الجسيمات الحالة وتتحلل محتوياتها.

ب. العودة إلى السطح - إعادة تدوير المواد - تندمج حويصلة مع غشاء بلازما.

ج. فرز - قد لا يذهب كل شيء في الحويصلة إلى نفس المكان. قد تندمج الحويصلة مع الجسيم الداخلي (حويصلة الفرز) ، وقد يتم توجيه أجزاء مختلفة من المادة الملتصقة إلى جهات مختلفة. (مزيد من التفاصيل حول a-c أدناه.)

د . ترانسسيتوسيس - الحويصلة تعبر الخلية وتندمج مع سطح الخلية المقابل. للحصول على أمثلة ، انظر النشرة 6C أو رسم تخطيطي للشفرات (يوضح كيف تدخل الأجسام المضادة في التجويف)

(1). يتطلب مستقبلًا: يتطلب الترشيح مستقبلًا لكل مادة يتم نقلها. لا يظهر المستقبل على 6C ولكن يظهر بوضوح في الرسم التخطيطي للشفرات

(2). Transcytosis = كثرة الخلايا في نهاية + خروج الخلايا = خطوتان

(أ). ترتبط المادة بالمستقبل وتلتحم على سطح واحد من الخلية.

(ب). تتحرك الحويصلة عبر الخلية ويتم طرد المادة على سطح مختلف.

(3). وظيفة. يمكن استخدامه لتحريك البروتينات عبر الخلية في أي اتجاه. انظر الأمثلة أعلاه أو RP3.

ب. مراحل الدورة (تطابق الأرقام الخطوات في النشرة 6 ب). انقر هنا للرسوم المتحركة.

  • قد يحتوي الجسيم الداخلي الفردي على العديد من المستقبلات والروابط المختلفة ، ويتم فرز أخرى مختلفة بشكل مختلف. (ترد بعض الأمثلة بالتفصيل أدناه).
  • يمكن تسمية الحويصلة غير المطلية بالحمض بالجسم الداخلي أو الجسيم الداخلي المبكر أو حويصلة الفرز.
  • يتطلب التحمض طاقة لتشغيل مضخة البروتون - لنقل H + إلى حويصلة على حساب ATP. المضخة في غشاء الحويصلة.

ملاحظة: تفاصيل الفرز وإعادة التدوير - الخطوات المتبقية - تختلف باختلاف المادة الملقحة. مزيد من التفاصيل أدناه للحالات الفردية.

(7). انقسامات إندوسوم. المادة التي نتبعها ، و / أو مستقبلها ، يمكن أن ينتهي بها المطاف في النصف.

في المثال الموضح في النشرة ، يحصل النصف على المستقبل والنصف الآخر يحصل على الترابط ، كما هو الحال بالنسبة لـ LDL. ستتم مناقشة أمثلة أخرى في الفصل وسيتم توضيحها بالتفصيل أدناه.

ملحوظة: الجسيم الداخلي قد لا ينقسم ببساطة في خطوة واحدة قد تكون عملية الفرز تدريجية. قد تتبرعم القطع ذات التركيب المختلف تدريجياً مع تغير التركيب الداخلي للباقي.

(8). ماذا يحدث للأجزاء المختلفة من الجسيم الداخلي؟

8 أ. مصير الحويصلة مع المواد المراد إعادة تدويرها (المستقبلات و / أو الناقلات) - تندمج هذه الحويصلة مع غشاء البلازما في الخطوة 9. (في حالة LDL ، ستحتوي هذه الحويصلة على مستقبل LDL.)

8 ب. مصير الحويصلة مع المادة التي تبقى داخل الخلية - الحويصلة تسلم المحتويات إلى حجرة الخلية المناسبة. (بالنسبة إلى LDL ، تنقل الحويصلة LDL إلى الجسيمات الحالة ، لذلك تتحلل المادة.)

(9). يحدث خروج الخلايا - يعيد المستقبلات و / أو المكونات الأخرى إلى غشاء البلازما أو خارج الخلية.

جرب المشكلة 2-6.

ج- بعض الأمثلة المحددة

1. LDL (بروتين دهني منخفض الكثافة ) - مستقبلات معاد تدويرها ، لكن اللجند (بما في ذلك جزء البروتين) تدهور. انظر Becker، Box 12B أو نص Sadava Ch. 51.4 (50.4). ربما تم تضمين العديد من تفاصيل LDL بشكل عام ، ولكن تم تلخيصها أدناه. انقر هنا للحصول على صورة LDL.

أ. ما هو LDL؟ جسيم بروتين شحمي يحتوي على استرات الكوليسترول + بعض الدهون الأخرى + بروتين. يحتوي الجسيم على كوليسترول مُستَرِّد مغطى بطبقة أحادية من الدهون الأمفيباثية (فوسفوليبيد بالإضافة إلى بعض الكوليسترول غير المُستَقر) + جزيء واحد من البروتين (أبوبروتين ب أو أبوب).

ب. لماذا LDL؟

(1) لماذا أحادي الطبقة في الخارج؟ الذوبان. الكوليسترول غير قابل للذوبان في الدم. (كاره للماء.) الحاجة إلى وسيلة لنقل الكوليسترول عبر الدم إلى الخلية - يتطلب نقل الكوليسترول تكوين جسيمات ذات سطح محب للماء

(2) لماذا البروتين (apoB)؟ للارتباط بمستقبلات سطح الخلية (مستقبلات LDL). هناك حاجة إلى بروتين ليجند لربط المستقبل.

(3) ملخص لأدوار أجزاء من LDL:

(1). بروتين (apoB) = يجند = ما يربط بالفعل مستقبلات LDL = جزء بروتين من LDL

(2). الكوليسترول - ما تحتاجه الخلية فعليًا هو جزء الكوليسترول (لبناء أغشيتها و / أو تخليق الهرمونات).

ج. يُعاد تدوير المُستقبل ، وليس جزء البروتين من البروتين الدهني منخفض الكثافة. ملحوظة: يوجد نوعان من البروتينات المنفصلة هنا يمكن الخلط بينهما بسهولة

(1) مستقبلات البروتين على سطح الخلية = مستقبل LDL = يربط LDL ويسمح بامتصاص الكوليسترول

(2) البروتين في LDL (apoB) = يجند لمستقبل LDL = جزء من LDL ويساعد على حمل الكوليسترول عبر الدم.

د. يتم فصل المستقبلات و apoB داخل حويصلات الفرز / الإندوسومات الداخلية. كل البروتين الدهني منخفض الكثافة (بما في ذلك البروتين) يبقى منفصلاً عن المستقبلات

ه. تحتاج الجسيمات لتحطيم بروتين LDL وإطلاق الكوليسترول (يجب تقسيم استرات الكوليسترول في LDL لاستخدام الكوليسترول). كيف يصل LDL إلى الجسيمات؟ من خلال اندماج الحويصلات. إما:

(1). الحويصلات / الإندوسومات التي تحمل فتيل الركيزة مع الجسيمات الحالة الموجودة مسبقًا ، أو

(2). حويصلات V مع ركيزة تندمج مع حويصلات من Golgi تحمل هيدروليسات مصنوعة حديثًا لتشكيل ليسوسومات جديدة. (مزيد من التفاصيل حول كيفية مرور hydrolases عبر Golgi واستهداف الجسيمات الحالة ليتم مناقشتها لاحقًا.)

F. وظيفة امتصاص LDL - لتزويد المغذيات (الكوليسترول).

ز. المصطلحات الحالية: العلاقة بين الإندوسومات المبكرة والداخلية المتأخرة والليزوزومات الأمبيرية. ملاحظة: معظم هذا لمعلوماتك. في هذه الدورة ، سيتم استخدام المصطلح & quotendosomes & quot لكل من الجسيمات الداخلية المبكرة والمتأخرة.

(1). الجسيم الداخلي المبكر = فرز الحويصلة. يستخدم المصطلح بشكل مختلف من قبل مؤلفين مختلفين. يمكن & quot ؛ & quot ؛ & quot ؛ & quot ؛ في المسار إلى الخلية (عن طريق الالتقام الخلوي) و / أو & quot ؛ & quot ؛ على المسار من Golgi إلى الجسيمات الحالة. لذلك ، يمكن أن تعني الإندوسومات المبكرة:

(أ) حويصلات غير مغلفة ومحمضة من غشاء غشاء البلازما الذي يحمل مادة ملتحمة حديثًا ،

(ب). حويصلات قادمة من جولجي تحمل بروتينات مصنوعة حديثًا (المزيد حول هذا لاحقًا).

(2). الجسيم الداخلي المتأخر = حويصلة تحتوي على إنزيمات تحلل مائي مخصصة لليزوزومات (ولكن لم يتم تنشيطها بعد) بالإضافة إلى ركيزة محتملة. أكثر حمضية من الجسيم الداخلي المبكر. تم التخلص من المواد غير المخصصة للجسيمات الحالة. يتكون من نضوج الجسيم الداخلي المبكر.

(3). الجسيمات المحللة = حويصلة تحتوي على إنزيمات وركيزة متحللة مائيّة نشطة. أكثر حمضية من الجسيم الداخلي المتأخر. يتكون من نضوج الجسيم الداخلي المتأخر و / أو الاندماج مع الليزوزوم الموجود مسبقًا.

(4). المصطلحات القديمةوجدت في بعض النصوص (لمعلوماتك فقط):

(أ). ليسوسوم أولي = حويصلة تحتوي على إنزيمات تحلل فقط.

(ب). الليزوزوم الثانوي = الإنزيمات + الركيزة = نتيجة اندماج الليسو الأولي. + حويصلة أخرى تحتوي على ركيزة.

2. EGF (عامل نمو البشرة) - يتحلل كل البروتين المعني (يجند + مستقبلات)

أ. لا حاجة ليجند بروتين منفصل EGF هو بروتين - على عكس الكوليسترول ، أو Fe (انظر الحالة أدناه). يرتبط EGF نفسه بالمستقبل = يجند لمستقبلات سطح الخلية ومادة الأمبير التي سيتم نقلها إلى الخلية.

ب. وظيفة الامتصاص - لتنظيم التشوير. EGF هو جزيء إشارة. Uptake يوقف الإشارة و ينظم أسفل المستقبلات (يقلل عدد مستقبلات سطح الخلية).

ج. المستقبل لا يعاد تدويره - تحلل يجند (جزيء الإشارة) والمستقبلات معًا.

د. تحتاج الجسيمات (لتحطيم كل من المستقبلات و ligand).

3. الحديد / ترانسفيرين - لا يتحلل أي من البروتين المعني - يتم إعادة تدويره بالكامل

أ. ما هو الترانسفيرين؟ يحتاج الحديد إلى بروتين (مثل الكوليسترول يحتاج إلى apoB) للنقل والارتباط ببروتين المستقبل (= يجند لمستقبل الخلية) يسمى ترانسفيرين.

ب. يتم إعادة تدوير كل من مستقبلات الأبوترانسفيرين والأمبير .

ج. لا حاجة إلى الجسيمات الحالة - يتم نقل الحديد من الإندوسوم (باستخدام بروتين ناقل أو قناة في الغشاء) ولا يتحلل أي بروتين.

د. ينفصل الترانسفيرين والمستقبلات في الخارج خلية بعد إعادة التدوير

(1). يرتبط الحديد / الترانسفيرين بالمستقبل عند درجة الحموضة المحايدة ويدخل الخلية بواسطة RME.

(2). داخل الخلية ، ينتقل الحديد من الحويصلة إلى السيتوبلازم ، تاركًا Apo-transferrin عالقًا بالمستقبل (& quotapo & quot يعني بدون رابط ، أو عامل مساعد ، وما إلى ذلك).

(3). يلتصق Apo-transferrin (= ترانسفيرين بدون Fe) بالمستقبل عند درجة حموضة منخفضة (في الجسيم الداخلي) ولكنه ينفصل عند درجة حموضة محايدة (الخلية الخارجية). هذا مخالف للسلوك المعتاد - تلتصق معظم الروابط بالمستقبلات عند درجة الحموضة المحايدة ولكنها منفصلة عند درجة الحموضة المنخفضة الموجودة في الجسيم الداخلي. (درجة الحموضة المنخفضة تكسر العديد من الروابط الضعيفة).

(4). لاحظ أن apo-transferrin و Fe / ترانسفيرين لهما ارتباطات مختلفة للمستقبل عند درجة الحموضة المحايدة. في ظل هذه الظروف (درجة الحموضة المحايدة) ، يرتبط الحديد / الترانسفيرين بالمستقبل ، ويفصل أبو ترانسفيرين عن المستقبل.

ه. وظيفة الامتصاص - لتزويد المغذيات (Fe).

د. كمرجع: قارن & amp Contrast للأمثلة الموضحة أعلاه لنقل X

ترانسفيرين LDL EGF
ما الذي يحمله (ما هو X)؟ الحديد الكوليسترول عامل النمو
وظيفة X التمثيل الغذائي (الحديد هو العامل المساعد للعديد من البروتينات) الأيض (الكوليسترول هو أحد مكونات أغشية الخلايا المستخدمة في تخليق الهرمونات) الإشارة
يجند (ما الذي يرتبط بالمستقبلات؟) ترانسفرين = أبوترانفيرين + حديد LDL EGF
هل يحتوي اللجند على بروتين بالإضافة إلى X؟ نعم (أبوترانسفيرين) نعم (ApoB) لا
مصير يجند (جزء بروتين) المعاد تدويره هضم هضم
مستقبل المستقبل المعاد تدويرها المعاد تدويره هضم
هل ينفصل جزء البروتين من الليجند ومستقبلات الأمبير داخل الخلية؟ لا نعم لا
الجسيمات المتورطة؟ لا نعم نعم
أين يفصل اللجند ومستقبلات الأمبير؟ خارج الزنزانة في الإندوسومات لا ينفصل - كلاهما متدهور


رابعا . وضع العلامات - كيف تتابع المواد التي تدخل الخلية؟ انظر النشرة 6C ، أعلى.

أ. أنواع الملصقات (باستخدام أدوات التتبع المضافة)

1. وضع العلامات المستمر - قم بالتبديل من المواد العادية العادية إلى المواد ذات الملصقات (المواد التي تحتوي على نشاط إشعاعي ، وميض ، وما إلى ذلك) واتبع ما يتم تسميته أولاً (بالنشاط الإشعاعي ، والفلورة ، وما إلى ذلك) ، وما يتم تسميته بعد ذلك ، وما إلى ذلك. سنناقش وضع العلامات المشعة ، لكن المبدأ هو نفسه سواء كان الملصق نشاطًا إشعاعيًا ، أو مضانًا ، إلخ.

2. تجارب Pulse-Chase - توفير المواد المشعة لفترة وجيزة (نبضة) ثم العودة إلى المواد العادية غير المشعة (مطاردة). اتبع حيث يذهب النشاط الإشعاعي. & quotpulse & quot يمر عبر الخلية مثل الماوس عبر مضيق بوا. تمامًا كما تنتفخ أجزاء مختلفة من عائق الأفعى مؤقتًا بينما يمر الفأر أسفل الثعبان ، تصبح أجزاء مختلفة من الخلية مشعة مؤقتًا ، واحدة تلو الأخرى ، مع مرور المادة المشعة. ثم مع مرور & quotpulse & quot أو & quotmouse & quot ، سيعود كل جزء إلى الحجم الطبيعي - غير المشع أو الحجم الطبيعي ، اعتمادًا على ما إذا كنا نشير إلى الخلية أو إلى الثعبان.

ب. الكشف - كيف تجد مكان النشاط الإشعاعي (أو أي مادة تتبع / ملصق استخدمته)؟

1. التصوير الشعاعي الذاتي - قم بتغطية طبقة من الخلايا المصنفة بمستحلب فوتوغرافي وعدّ الحبوب المشعة فوق كل عضية أو جزء من الخلية. هذه الطريقة تشبه فعل فى الموقع المقايسات ، حيث تقوم بفحص الخلايا السليمة لتحديد موقع ما تبحث عنه. انظر Becker، Appendix، A-17 (A-18) أو دليل الفحص المجهري.

ملاحظة: يحتوي ملحق بيكر (أو دليل الفحص المجهري في الطبعة الخامسة) على الكثير من المعلومات الأساسية المفيدة حول الأساليب المجهرية ، بما في ذلك التألق المناعي ، والكسر بالتجميد ، وما إلى ذلك.

للحصول على صورة للنتائج النموذجية ، انظر الشكل. 12-10 من كتاب بيكر (الطبعة السابعة) أو انقر هنا.تم الحصول على هذه الصور باتباع المواد المصنوعة حديثًا من الخلية ، وليس اتباعها. ومع ذلك ، فإن المبدأ هو نفسه - فهو يظهر التسمية في أجزاء الخلية المختلفة في أوقات مختلفة.

2. الكسر أولا - تفكيك العينات الموصوفة ، وتقسيمها إلى عضيات مختلفة ، وقياس النشاط الإشعاعي في كل جزء. هذا مشابه لإجراء & quotgrind & find & quot ، حيث تقوم بتفكيك الخلايا ، وفصلها إلى أجزائها ، واختبار حل أو تعليق لكل جزء لما تبحث عنه.

لمراجعة وضع العلامات و RME ، جرب المشكلات 2-8 & amp 2-11 الآن ، يجب أن تكون قادرًا على حل جميع المشكلات في مجموعة المشكلات 2 & amp 2R.

في المرة القادمة: كيف يتم فرز البروتينات إلى مكانها الصحيح؟ كيف تدخل الجزيئات وتخرج من النواة؟


بريان ريموند

يتم إثراء تعقيد جينوم حقيقيات النوى من خلال الإنترونات المدمجة التي توسع عدد البروتينات التي ينتجها التضفير البديل ، وتوفر بيئات فريدة لتضمين الجينات والعناصر التنظيمية ، وتخلق فرصًا لتجميع الجينات الجديدة من خلال إعادة التركيب وتطور intron. تأتي هذه الفوائد بتكلفة ، حيث أن ما يقرب من 15 ٪ من الاضطرابات الوراثية البشرية تنتج عن أخطاء الربط المرتبطة بطفرات cis (ركيزة الربط) التي تغير أنماط لصق محددة الجينات أو طفرات عبر (وحدة فرعية spliceosome) التي قد تضعف ما قبل عام. -مرنا الربط. إن الفهم الأفضل لتكوين الجسيمات والأساس الجزيئي لاختيار موقع لصق سيسهل التشخيص ، وفي النهاية ، علاج أو تصحيح الاضطرابات المرتبطة بالربط. إن مساهمة تجميع spliceosome في آلية الربط pre-mRNA هو محور عملنا.

قد تحتوي جينات Metazoan على العشرات من حدود intron / exon ، وبعضها يستخدم فقط استجابة لإشارات إنمائية أو بيئية محددة. بالنسبة للعديد من الجينات ، يعد التوظيف المستقر لـ U2 snRNP في منطقة نقطة التفرع الخاصة بـ pre-mRNA الذي يعدل اختيار موقع لصق. يعد التعرف على نقطة الفروع قبل mRNA أمرًا معقدًا ، وحتى في حالة النصوص غير المنظمة ، يتقدم من خلال الارتباط المتسلسل لعوامل الربط المتعددة (على سبيل المثال ، SF1 / BBP - U2AF65 / Mud2p) و snRNPs (U1 ، U2 ، و U6).

في حين أن المسار الأساسي لتجميع spliceosome محفوظ جيدًا من خلال التطور ، خميرة الخميرة (من الآن فصاعدًا الخميرة) تفتقر إلى منظمات عامل الربط SR الكنسي الموجودة في metazoa وتعتمد على عناصر إجماع pre-mRNA محفوظة بشكل صارم لتوجيه اختيار موقع لصق. كما أن بنية جين الخميرة أبسط ، مع وجود عدد قليل من الجينات التي تحتوي على أكثر من إنترون واحد. وفقًا لذلك ، تقدم الخميرة نموذجًا ممتازًا للتحقيق في تجميع ووظيفة جهاز التضفير القاعدي في غياب المضاعفات الناتجة عن التنظيم الجيني المعقد والتضفير. حاليًا ، نستخدم الأساليب الجينية والبروتينية للتحقيق في ديناميكيات اختيار نقطة التفرع السابقة للـ mRNA في المختبر وفي الخلايا الحية.

  • Martínez-Matías، N Chorna، N González-Crespo، S Villanueva، L Montes-Rodríguez، I Melendez-Aponte، LM Roche-Lima، A Carrasquillo-Carrión، K Santiago-Cartagena، E Rymond، BC Babu، M Stagljar، I Rodriguez-Medina ، JR "نحو اكتشاف الوظائف البيولوجية المرتبطة بالمستشعر الميكانيكي Mtl1p لـ Saccharomyces cerevisiae عن طريق التحليل التكاملي متعدد OMICs." التقارير العلمية 11 ، 1 (2021): 7411. التفاصيل. نص كامل
  • ريفيرا-روبلز ، إم جي مدينا-فيلاسكيز ، جي أسينسيو-توريس ، جي إم غونزاليس-كريسبو ، إس ريموند ، كولومبيا البريطانية رودريغيز-مدينا ، جي دارماواردهان ، إس "استهداف Cdc42 بمركب مضاد للسرطان MBQ-167 يثبط قطبية الخلية ونموها في الخميرة الناشئة S. cerevisiae ". GTPases الصغيرة 11 ، 6 (2020): 430-440. التفاصيل نص كامل
  • Vélez-Segarra، V González-Crespo، S Santiago-Cartagena، E Vázquez-Quiñones، LE Martínez-Matías، N Otero، Y Zayas، JJ Siaca، R Del Rosario، J Mejías، I Aponte، JJ Collazo، NC Lasso، FJ Snider ، J Jessulat ، M Aoki ، H.Rymond ، BC Babu ، M Stagljar ، I Rodriguez-Medina ، JR "تفاعلات البروتين للبروتينات الحسية الميكانيكية Wsc2 و Wsc3 لمقاومة الإجهاد في & lti & gtSaccharomyces cerevisiae & lt / i & gt." G3 (بيثيسدا ، ماريلاند) 10 ، 9 (2020): 3121-3135. تفاصيل.
  • سانتياغو قرطاجنة ، إي غونزاليس كريسبو ، إس فيليز ، في مارتينيز ، إن سنايدر ، جي جيسولات ، إم أوكي ، مينيك ، زي أكامين ، بي ميجياس ، آي بيريز ، إل إم ريموند ، بي سي بابو ، إم ستاجلجار ، آي رودريغيز- Medina، JR "تحديد واختبار وظيفي لشركاء البروتين المتفاعل الجديد لأجهزة استشعار الإجهاد Wsc1p و Mid2p من & lti & gtSaccharomyces cerevisiae & lt / i & gt." G3 (بيثيسدا ، ماريلاند) 9 ، 4 (2019): 1085-1102. تفاصيل.
  • سانتياغو ، إي أكامين ، بي سنايدر ، جي وونغ ، في جيسولات ، إم دينيكو ، في جاجارينوفا ، أوكي ، إتش مينيك ، زي فانسي ، إس سان أنطونيو ، كوبانو ، لا ريمون ، بي سي بابو ، إم ستاجلجار ، آي رودريغيز-مدينا ، JR "Novel Interactome of Saccharomyces cerevisiae Myosin Type II التي تم تحديدها بواسطة شاشة غشائية مدمجة ثنائية الهجين (iMYTH)." G3 (بيثيسدا ، ماريلاند) 6 ، 5 (2016): 1469-1474. تفاصيل.
  • Banerjee، D McDaniel، PM Rymond، BC "قابلية محدودة لنقل نطاقات G-patch في منظمات هليكاز Prp43 RNA المطلوبة لربط ما قبل mRNA ونضج RNA الريبوزومي في Saccharomyces cerevisiae." علم الوراثة 200 ، 1 (2015): 135-47. التفاصيل نص كامل
  • Rymond، BC "بروتين ربط نقطة التفرع: داخل وخارج دورة spliceosome." التقدم في الطب التجريبي وعلم الأحياء 693 ، (2010): 123-41. تفاصيل.
  • Pandit، S.Paul، S.Zhang، L.Chen، M.Durbin، N.Harrison، SM Rymond، BC "Spp382p يتفاعل مع عدة عوامل ربط للخميرة ، بما في ذلك المنظمات المحتملة لوظيفة بروتين Prp43 DExD / H-Box." علم الوراثة 183 ، 1 (2009): 195-206. التفاصيل نص كامل
  • Wang ، Q.Zhang ، L.Lynn ، B.Rymond ، BC "يتوسط مغاير متغاير BBP-Mud2p التعرف على نقطة التفرع ويؤثر على وفرة الركيزة في التضفير في الخميرة الناشئة." أبحاث الأحماض النووية 36 ، 8 (2008): 2787-98. التفاصيل نص كامل
  • Rymond ، B. "استهداف spliceosome." بيولوجيا الطبيعة الكيميائية 3 ، 9 (2007): 533-5. التفاصيل نص كامل
  • Pandit، S.Lynn، B.Rymond، BC "تثبيط مسار دوران الجسيمات الملصقة يمنع عيوب التضفير." وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية 103 ، 37 (2006): 13700-5. التفاصيل نص كامل
  • Wang ، Q.He ، J.Lynn ، B.Rymond ، BC "تفاعلات عامل التضفير SF3b الخميرة." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 25 ، 24 (2005): 10745-54. التفاصيل نص كامل
  • Dembla-Rajpal، N.Seipelt، R.Wang، Q.Rymond، BC "تثبيط البروتوزوم يغير نسخ جينات الخميرة المتعددة." Biochimica et biophysica acta 1680 ، 1 (2004): 34-45. التفاصيل نص كامل
  • Wang، Q.Rymond، BC "مطلوب Rds3p لتوظيف U2 snRNP المستقر في جهاز الربط." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 23 ، 20 (2003): 7339-49. التفاصيل نص كامل
  • Vincent، K.Wang، Q.Jay، S.Hobbs، K.Rymond، BC. علم الوراثة 164 ، 3 (2003): 895-907. تفاصيل.
  • Wang، Q.Hobbs، K.Lynn، B.Rymond، BC "إن عامل التضفير Clf1p يعزز التجميع المتصلب من خلال اتصالات تكرار ببتيد رباعي طرفي N." مجلة الكيمياء البيولوجية 278 ، 10 (2003): 7875-83. التفاصيل نص كامل
  • Chung ، S.Zhou ، Z.Huddleston ، KA Harrison ، DA Reed ، R.Coleman ، TA Rymond ، BC Biochimica et biophysica acta 1576 ، 3 (2002): 287-97. التفاصيل نص كامل
  • Chung، S.McLean، MR Rymond، BC "تقويم تقويم الخميرة لبروتين العنق الملتوي ذبابة الفاكهة يعزز تجميع الجسيمات من خلال إضافة U4 / U6.U5 snRNP المستقرة." RNA (نيويورك ، نيويورك) 5 ، 8 (1999): 1042-54. التفاصيل نص كامل
  • Seipelt، RL Zheng، B. Asuru، A.Rymond، BC "يتم شق U1 snRNA بواسطة RNase III ومعالجتها من خلال مسار يعتمد على موقع Sm." أبحاث الأحماض النووية 27 ، 2 (1999): 587-95. التفاصيل نص كامل
  • Lybarger ، S.Beickman ، K.Brown ، V.Dembla-Rajpal ، N. في النضج spliceosome ". البيولوجيا الجزيئية والخلوية 19 ، 1 (1999): 577-84. التفاصيل نص كامل
  • Xie ، J.Beickman ، K.Otte ، E.Rymond ، BC "يتطلب التقدم خلال دورة spliceosome وظيفة Prp38p لتفكك U4 / U6 snRNA." مجلة EMBO 17 ، 10 (1998): 2938-46. التفاصيل نص كامل
  • McLean ، MR Rymond ، BC "تتطلب عملية تضفير الخميرة قبل الرنا المرسال زوجًا من بروتينات تكرار رباعي الببتيد المرتبطة بـ U1 snRNP." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 18 ، 1 (1998): 353-60. التفاصيل نص كامل
  • Roy ، J.Zheng ، B.Rymond ، BC Woolford JL ، Jr "الخميرة ذات الصلة من الناحية الهيكلية ولكن المتميزة وظيفيًا ، بروتينات جزيئات البروتين النووي الصغيرة ذات النواة الصغيرة." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 15 ، 1 (1995): 445-55. التفاصيل نص كامل
  • Rodriguez-Medina، JR Rymond، BC "انتشار وتوزيع الإنترونات في جينات الخميرة البروتينية غير الريبوسومية." الوراثة الجزيئية والعامة: MGG 243 ، 5 (1994): 532-9. تفاصيل.
  • لوكهارت ، SR Rymond ، BC "يتطلب التزام الخميرة قبل الرنا المرسال بمسار التضفير عديد ببتيد بروتين نووي صغير نووي U1 ، Prp39p." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 14 ، 6 (1994): 3623-33. التفاصيل نص كامل
  • Rymond، BC Rokeach، LA Hoch، SO "يعزز عديد الببتيد البشري snRNP D1 تضفير ما قبل mRNA في الخميرة ويحدد متواليات Smd1p الخميرة غير الأساسية." أبحاث الأحماض النووية 21 ، 15 (1993): 3501-5. التفاصيل نص كامل
  • Rymond ، BC "النصوص المتقاربة لموضع الخميرة PRP38-SMD1 ترمز عاملين أساسيين للربط ، بما في ذلك عديد ببتيد النواة D1 لجزيئات البروتين النووي الصغيرة." وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية 90 ، 3 (1993): 848-52. التفاصيل نص كامل
  • Blanton، S.Srinivasan، A.Rymond، BC "PRP38 يشفر بروتين الخميرة المطلوب لربط ما قبل الرنا المرسال والحفاظ على مستويات الحمض النووي الريبي الصغيرة U6 المستقرة." البيولوجيا الجزيئية والخلوية 12 ، 9 (1992): 3939-47. التفاصيل نص كامل
  • Rymond، BC "تحديد مواقع ما قبل MRNA / رابطة spliceosome." نشرة SAAS ، الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية 4 ، (1991): 76-80. تفاصيل.
  • Rymond، BC "بروتين ربط نقطة التفرع: داخل وخارج دورة spliceosome." التقدم في الطب التجريبي وعلم الأحياء 693 ، (0): 123-41. تفاصيل.

ريموند ، كولومبيا البريطانية ، أمضي في طريقي؟ حكاية توظيف وتفعيل إنزيم 2016 ، أطلس العلوم,


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


النتائج

تم استخدام استخراج المنظفات التفاضلية لتقييم قابلية استخراج كينيسين في الخلايا المستنبتة. يؤدي الاستخراج الموجز للخلايا التي تحتوي على 0.015٪ من الديجيتونين إلى إحداث ثقوب في غشاء البلازما مع الحد الأدنى من التأثيرات على العضيات داخل الخلايا (Mackall وآخرون.، 1979 Womack وآخرون.، 1983 رامسبي وماكوسكي ، 1998). تُطلق الخلايا المستنبتة المستخرجة في ظل هذه الظروف 90-100٪ من الواسمات العصارية الخلوية التقليدية مثل اللاكتات ديهيدروجينيز والأنهيدراز الكربوني ، ولكن يتم الاحتفاظ بعلامات الميتوكوندريا والليزوزومات والشبكية الإندوبلازمية (رامسبي) وآخرون.، 1994). تشمل البروتينات التي يطلقها العلاج بالديجيتونين الميوسين الثاني والكالباستاتين والبروتينات الأخرى و gt300 كيلو دالتون في الكتلة الجزيئية (Weigel وآخرون.، 1983 رامسبي وآخرون.، 1994). في المقابل ، فإن استخراج الخلايا باستخدام Triton X-100 يذوب العديد من غشاء البلازما وبروتينات الغشاء العضوي داخل الخلايا بطريقة تعتمد على الوقت والتركيز (Ramsby and Makowski ، 1998).

تمت مقارنة سلوك الكينيسين أثناء استخلاص المنظفات مع سلوك البروتين المعروف بأنه قابل للذوبان في الجسم الحي. تم إصلاح خلايا BHK21 التي تعبر بشكل أساسي عن GFP مباشرة أو استخلاصها قبل التثبيت إما باستخدام Triton X-100 أو digitonin (الشكل 1). عند التثبيت بدون الاستخراج ، تم الاحتفاظ بـ GFP في الخلية ، ولكن حتى معالجات المنظفات الأكثر اعتدالًا أدت إلى فقد سريع لـ GFP السيتوبلازمي ، ولم يتبق سوى جزء صغير متبقي في النوى. اقترحت المقارنة بين توزيعات GFP و kinesin في الخلايا غير المستخرجة أن هذين البروتينين لا يتحدان. تغلغل GFP في الخلية ، متطابقًا جيدًا مع حدود الخلية وسمكها ، ولكن يبدو أن نشاط مناعة كينيسين كان أكثر تقييدًا ، وربما يكون مخصبًا في مجالات خلوية محددة.

التين. 1. يتم تحرير GFP القابل للذوبان ولكن ليس كينيسين من خلايا المنظفات المنفذة. تظهر الصور الفلورية للخلايا غير المستخرجة (A) و 0.015٪ المستخلص من الديجيتونين (B) و 0.1٪ من خلايا Triton X-100 المستخرجة (C) من النوع البري BHK21 (H2) أو BHK21 الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن GFP. بعد التثبيت ، تمت معالجة الخلايا من أجل التألق المناعي باستخدام جسم مضاد للفأر مضاد لـ KHC (H2) أو تم تصوير مضان GFP مباشرة (GFP أخضر ، العمود الأيسر). تم تلطيخ جميع الخلايا أيضًا بجسم مضاد للتوبيولين (أحمر) ومع العلامة النووية To-Pro3 (العمود الأوسط الأزرق). الصور المدمجة عبارة عن تراكبات من صور ذات ألوان زائفة باللون الأخضر والأحمر والأزرق (العمود الأيمن). تفصل الخطوط الملونة الرفيعة صور الخلايا عن الحقول المختلفة. يختلف نمط نشاط مناعة كينيسين عن مضان GFP حتى في الخلايا غير المستخرجة. تكون هذه الاختلافات أكثر وضوحًا بعد استخلاص المنظفات. يزيل استخراج المنظفات المعتدلة (الديجيتونين) معظم GFP ، باستثناء الجزء النووي المتبقي. في المقابل ، يظل نشاط مناعي كينيسين ملحوظًا في جميع أنحاء الخلية حتى بعد استخراج المنظفات الأكثر قسوة (Triton X-100) ، مما يشير إلى أن معظم كينيسين غير قابل للذوبان.

كشف استخراج الديجيتونين قبل التثبيت عن اختلافات لافتة للنظر بين GFP وتوطين كينيسين (الشكل 1). تم استخراج جميع GFP تقريبًا من المجالات السيتوبلازمية في غضون 4 دقائق ، ولم يتبق سوى إشارة ضعيفة في النواة. في المقابل ، بقي الجزء الأكبر من الكينيسين على هيئة هياكل منفصلة غالبًا ما كانت قريبة من الأنابيب الدقيقة في دراسات مزدوجة التسمية. يبقى نشاط مناعي كينيسين نقطيًا كبيرًا حتى بعد عمليات الاستخراج الأكثر صرامة باستخدام Triton X-100 في ظل الظروف التي يبدأ فيها استخراج العضيات داخل الخلايا (Ramsby and Makowski ، 1998). على الرغم من انخفاض نشاط مناعة كينيسين مع علاج Triton X-100 (الشكل 1) ، إلا أن الكثير من كينيسين ظل على شكل هياكل نقطية. الاستخراج الأطول وتركيزات أعلى من Triton X-100 التي تعطل الأغشية الداخلية تقلل إلى حد كبير من نشاط مناعة كينيسين (Morfin وآخرون.2000 الاخت وآخرون.، 1989 ب). كما أدى استخراج Triton X-100 إلى التخلص بشكل أساسي من جميع GFP السيتوبلازمي ولكنه لم يكن أكثر فعالية من الديجيتونين في إزالة GFP النووي. على الرغم من أن طرق التألق المناعي هي شبه لغوية ، إلا أنها أثبتت أن معظم نشاط مناعة كينيسين يقاوم العلاجات التي تطلق بروتينات العصارة الخلوية.

يمكن الحصول على مقياس كمي أكثر للكينيسين المرتبط بأجسام MBO عن طريق التجزئة الخلوية. تم تقييم مستويات كينيسين من خلال الطقطقات المناعية الكمية لكسرين من العضيات المنقاة (V1 و V2) والطاف (S) باستخدام طرق تجزئة الخلايا القياسية. تمشيا مع التقارير السابقة (Hollenbeck ، 1989) ، كان 70 ٪ من kinesin الخلوي موجودًا في المادة الطافية مع مخازن التحكم (الشكل 2 أ). تم تقييم مجموعة واسعة من الظروف العازلة ومثبطات الإنزيم للقدرة على التأثير على تقسيم كينيسين بين الكسور الغشائية والذوبان. زاد العلاجان بشكل كبير من كمية كينيسين في كسور الغشاء: NEM ، عامل تعديل سلفهيدريل ، و EDTA ، مخلب للكاتيونات ثنائية التكافؤ. كلاهما كان فعالا في تركيزات الملليولار عند إضافته إلى مخازن التجانس.

التين. 2. آثار NEM على إطلاق كينيسين من الحويصلات أثناء التجانس. (أ) تم تنقية الحويصلات الميكروسومية عن طريق تجانس أدمغة الأبقار الطازجة إما مع 2 مم NEM أو بدونها. تم تحديد ثلاثة كسور: 39800 × زبيليه (V1) ، 260.000 × ز بيليه (V2) ، و 260.000 × ز طاف (S). تم فحص الكسور الطافية والحويصلة بحثًا عن وجود كينيسين باستخدام الجسم المضاد H2 على اللطخات المناعية الكمية كما هو موضح سابقًا (Pfister وآخرون.، 1989 ب). قلل وجود 2 ملي NEM أثناء التجانس من إطلاق كينيسين من الحويصلات أثناء التجانس. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM n = 3. (ب) تم تقييم اعتماد تركيز تأثيرات NEM على كمية كينيسين في V2 عن طريق تغيير تركيزات NEM المضافة إلى المخزن المؤقت للتجانس من 0.1 إلى 5.0 ملي مول قبل التجانس. تم قياس كمية Kinesin كما هو موضح أعلاه. غشاء قشر البيض الطبيعي بتركيزات من 1 إلى 2 ملي مولار يمنع إطلاق كينيسين من الحويصلات.

إضافة غشاء قشر البيض الطبيعي إلى المخزن المؤقت للتجانس قبل الاستخراج يؤدي إلى ألكيلات أي سلفهيدريل حر يمكن الوصول إليه أثناء التجانس ويثبط أنشطة الإنزيم التي تتطلب سلفهيدريلز حرة. زاد Millimolar NEM في المخزن المؤقت للتجانس من كمية البروتين الكلي في كل من كسور V1 و V2 فقط 5 ٪. في المقابل ، زادت كمية كينيسين المرتبطة بأجزاء الغشاء V1 و V2 بمقدار ثلاثة أضعاف تقريبًا ، حيث انتقلت من 0.5٪ إلى ∼1.5٪ من إجمالي البروتين. في ظل هذه الظروف ، & gt90٪ من kinesin المستعاد مقسم مع كسور الحويصلة بعد علاج NEM (الشكل 2) ، مقارنة بـ 30٪ من إجمالي kinesin في كسور الحويصلة في ظل الظروف القياسية. Kinesin المرتبط بـ MBOs بعد علاج NEM ظل مرتبطًا من خلال تجزئة التدرج السكروز ، مما يشير إلى أن زيادة كينيسين المرتبط بالغشاء مع علاج NEM لم يكن بسبب تجميع كينيسين قابل للذوبان. تمشيا مع هذا ، أظهرت الدراسات في المختبر حول تثبيط كينيسين ATPase ، وربط الأنابيب الدقيقة ومقايسات الانزلاق بواسطة NEM ، أن كينيسين المعالج بـ NEM لا يتجمع ولكنه يظل قابلًا للذوبان (Pfister وآخرون.، 1989a المناجل وآخرون.، 1996). تشير هذه التجارب إلى أن غشاء قشر البيض الطبيعي يثبط إطلاق كينيسين من الكائنات الحية الدقيقة أثناء التجانس واقترح أن مسارًا واحدًا على الأقل حساسًا لـ NEM في المستخلصات السيتوبلازمية يطلق كينيسين من الكائنات الحية الدقيقة أثناء التجانس.

تم إنتاج زيادة مماثلة من كينيسين في كسور الغشاء بإضافة 5 ملي مولار EDTA إلى مخازن التجانس. في الشكل 3 أ ، يوضح الرسم البياني العلوي أن NEM أو EDTA أو مزيج من علاجات NEM و EDTA كان له تأثير ضئيل على الكمية الإجمالية للبروتين في كسور الغشاء العصاري الخلوي والصوتاني. وبالمثل ، لم يغير أي من هذه العلاجات توزيع إما hsc70 ، وهو بروتين حشوي في الغالب ، أو synaptophysin ، وهو بروتين غشائي متكامل (الشكل 3 ب). ومع ذلك ، يُظهر الرسم البياني السفلي أن العلاج باستخدام NEM (51٪) أو EDTA (54٪) قد ضاعف أكثر من ضعف كمية كينيسين في كسور الغشاء مقارنةً بمخازن التحكم (26٪). أدت إضافة كل من NEM و EDTA إلى المخزن المؤقت للتجانس إلى زيادة كمية كينيسين في كسور الغشاء إلى ما يقرب من 80٪ (الشكل 3).تشير حقيقة أن تأثيرات NEM و EDTA على ارتباط كينيسين بالأغشية كانت مضافة جزئيًا على الأقل إلى أن مسارات متعددة قد توجد لإطلاق كينيسين من كائنات MBO ويتم تنشيطها أثناء بروتوكولات التجانس القياسية.

الشكل 3. NEM و EDTA يزيدان من كمية كينيسين في كسور الغشاء بعد التجزئة الخلوية. (أ) الرسوم البيانية الشريطية التي تظهر تقسيم البروتين الكلي والكينيسين في العصارة الخلوية مقابل كسور الغشاء. تظهر التغييرات في تقسيم kinesin في غياب (التحكم) أو وجود NEM أو EDTA أو NEM و EDTA معًا. تم حساب متوسط ​​مستويات كينيسين من نتائج طقطقتين مناعيتين كميتين. تشير الأشرطة إلى نطاق التباين. (ب) اللطخات المناعية التمثيلية التي توضح تقسيم كينيسين ، hsc70 ، وبروتين الغشاء المتكامل p38 في عينات التحكم والمعالجة. لم يتم تغيير تقسيم البروتين الكلي ، hsc70 ، و p38 بين كسور العصارة الخلوية والغشاء بواسطة العلاجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن جميع العلاجات تحولت بشكل كبير كينيسين من العصارة الخلوية إلى كسور الغشاء.

اقترحت قدرة NEM و EDTA على منع إطلاق كينيسين من MBOs عملية نشطة ولكنها لم تحدد المكونات الخلوية المسؤولة. أشارت الدراسات الكيميائية المناعية إلى تورط KLCs في ارتباط كينيسين بالحويصلات (Hirokawa وآخرون.، 1989 Stenoien and Brady ، 1997) ، لذلك تم فحص التسلسل الأولي لـ KLC للزخارف التي قد تكون متورطة في تنظيم ربط الغشاء. يحتوي المجال المركزي لـ KLC على خمسة تكرارات ترادفية غير كاملة لكل منها 42 من الأحماض الأمينية (Cyr وآخرون.، 1991). هذه التكرارات لها درجة عالية من التشابه مع بعضها البعض ويتم الحفاظ عليها بدرجة عالية بشكل غير عادي (هوية 95 ٪) عبر الأنواع (Brady ، 1995 Stenoien and Brady ، 1997). لقد أوضحت أعمالنا السابقة هذه المجالات المتكررة الترادفية في ارتباط كينيسين بـ MBOs ، لأن الجسم المضاد (KLC-ALL) الموجه ضد مجال التكرار أطلق كينيسين من حويصلات معزولة في المختبر وأعاق النقل المحوري السريع. نتيجة لذلك ، كان يُعتقد أن مجالات التكرار الترادفية لـ KLC تعمل على التوسط في تفاعلات طبقة ثنائية البروتين - البروتين أو البروتين - الشحوم اللازمة لربط كينيسين بـ MBOs (Stenoien and Brady ، 1997).

كشف تحليل متواليات KLC (الشكل 4) أن مجالات التكرار الترادفي تحتوي على متواليات محفوظة مميزة لعنصر "المجال J" الموصوف لأول مرة في DnaJ (Tsai and Douglas، 1996). الهيكل المتوقع لمجالات التكرار الترادفي (Cyr وآخرون.، 1991) كان متوافقًا أيضًا مع دالة المجال J (Hill وآخرون.، 1995 كيلي ، 1998). السمات المميزة لمجال J هي تسلسل HPD ثلاثي الببتيد بين امتدادات غنية بألفا حلزونية (الشكل 4) ، مما يخلق بنية تشبه الإصبع يمكن أن تتفاعل مع أعضاء عائلة hsp70 chaperone. تم العثور على مجموعة متنوعة من البروتينات لاحتواء J-domains ، والعديد منها يتوسط العمليات التي تنطوي على تفاعلات غشاء البروتين والمرافق الجزيئية (Cyr وآخرون.، 1994 كيلي ، 1998). يشير هذا إلى أن مرافق hsp70 قد يرتبط بـ KLC. تم اختبار عمل بروتينات hsp70 على تفاعلات kinesin-MBO من خلال تقييم قدرة hsc70 في المختبر على إطلاق kinesin من كسور الحويصلة المنقى (الشكل 5). تم تحضين حويصلات V2 المنقى مع أو بدون hsc70 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم إطلاق 5 ٪ فقط من كينيسين المرتبط بالحويصلة في المادة الطافية عن طريق الحضانة مع المخزن المؤقت وحده. في المقابل ، تم إطلاق 50 ٪ من كينيسين المرتبط من أسطح الحويصلة بواسطة حضانات في المختبر باستخدام hsc70 و ATP (الشكل 5 أ). من المحتمل أن يكون هذا أقل من تقدير لـ kinesin الذي يمكن إطلاقه بواسطة hsc70 ، لأن كسور الحويصلة المستخدمة في هذه الاختبارات تمت تنقيتها بواسطة طرق تجزئة الخلية القياسية. من المحتمل أن يكون إطلاق Kinesin بواسطة hsc70 أثناء التجانس أكثر شمولاً ، لأن الكثير من كينيسين المرتبط بالغشاء الداخلي قد فقد أثناء التنقية (الشكلان 2 و 3). تم أيضًا تقييم تأثير ATP وحده ، لأن ATP مطلوب لوظيفة hsc70. تم إطلاق ما يقرب من 12 ٪ من كينيسين في المادة الطافية للعينة بعد الحضانة باستخدام المخزن المؤقت بالإضافة إلى ATP في غياب hsc70 المضاف (الشكل 5). من المحتمل أن يكون هذا الإطلاق المعتمد على ATP ناتجًا عن تلوث hsc70 لكسور الحويصلة ، لأن كمية صغيرة من hsc70 كانت قابلة للاكتشاف باستمرار في الكسور المناعية لكسور الحويصلة (انظر الشكل 3). علاوة على ذلك ، أظهرت اللطخات المناعية ذات الجسم المضاد لـ hsc70 إطلاق hsc70 داخلي المنشأ من العينات فقط في وجود ATP مضاف (بياناتنا غير المنشورة).

الشكل 4. تماثل البنية والتسلسل بين تكرارات ترادفية KLC ومجالات J. محاذاة متواليات تكرار الترادف KLC مع تسلسل المجال J بدائية النواة من الإشريكية القولونية يظهر DnaJ واثنان من نطاقات J حقيقية النواة من auxilin و Sec63P (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). الأشكال الثابتة هي تسلسل أساسي لـ HPD (نجمة) وترتيب امتدادات قصيرة محاطة بحلزون ألفا (أقواس تحت تسلسلات مصطفة). يعتمد موضع الامتدادات الحلزونية ألفا على بنية الرنين المغناطيسي النووي لنطاقات J في DnaJ (Hillوآخرون.، 1995). تكون التسلسلات في هذه الامتدادات الحلزونية أكثر تنوعًا عبر أفراد الأسرة ، على الرغم من أن بعض البقايا تبدو إما محفوظة (أحرف تحت التسلسل) أو متجانسة (نقاط تحت التسلسل). يُظهر التظليل البقايا المحفوظة في تسلسلات متعددة للمجال J. توضح هذه المحاذاة أن التتابعات الأولية للتكرار الترادفي 1–2 و3–4 متوافقة مع دالة المجال J.

التين. 5. إطلاق كينيسين داخلي المنشأ من الحويصلات بواسطة Hsc70. تم إعادة تعليق حويصلات V2 (تمت تنقيتها بدون استخدام NEM كما هو موضح في النص) واحتضانها بتركيز 1 مجم / مل من البروتين الكلي مع أو بدون hsc70 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت للإفراج (HB بالإضافة إلى 75 ملي مول كلوريد) . تم استخدام Hsc70 بتركيز 10 ميكروغرام / مل لنسبة مولارية لـ hsc70: كينيسين 2: 1. بعد الحضانة ، تم طرد حويصلات V2 مؤخرًا عند 260.000 × ز، ثم تم فحص المواد الطافية والكريات بحثًا عن وجود كينيسين باستخدام الجسم المضاد H2 على الكتل المناعية الكمية كما هو موضح أعلاه. (أ) أطلق hsc70 المنقى 50 ٪ من كينيسين داخلي المنشأ المتبقي على حويصلات V2 بطريقة تعتمد على النيوكليوتيدات. يتطلب التفاعل Mg-ATP وتم حظره بواسطة نظير ATP غير مائي (AMP-PNP) و EDTA. كانت كمية كينيسين التي أطلقها hsc70 في هذا الاختبار قابلة للمقارنة مع تلك التي أطلقها جسم مضاد ضد مجال التكرار الترادفي KLC (Stenoien and Brady ، 1997). (ب) عند إضافة 2 ملي NEM إلى الحويصلات في المختبر في نفس الوقت مثل hsc70 (الوقت 0) ، يتم حظر الإطلاق بوساطة hsc70. تم القضاء على تثبيط إطلاق كينيسين بوساطة hsc70 بواسطة NEM عن طريق الإضافة المتزامنة لـ DTT (2 مم). إن قدرة NEM على تثبيط الإطلاق بوساطة hsc70 مسموحًا بتعريف دورة زمنية لإطلاق كينيسين. يمكن تقدير ذلك بإضافة NEM (2 مم) في الأوقات المحددة بعد بدء الحضانة ، حيث تكون بداية الحضانة هي إضافة hsc70. عندما يُسمح للتفاعل بالاستمرار لمدة 5 دقائق قبل إضافة NEM ، تم إطلاق كميات كبيرة من كينيسين. اكتمل إطلاق كينيسين بواسطة hsc70 بشكل أساسي ما بين 10 و 20 دقيقة ، لذا فإن إضافة NEM في بعض الأحيان و GT10 دقائق لم يكن لها أي تأثير على كمية كينيسين التي يطلقها hsc70. (ج) الهدف من تعديل NEM هو مكون الحويصلة ، وليس hsc70 نفسه. لتحديد موقع العمل لـ NEM ، تمت مقارنة كمية كينيسين المتبقية المرتبطة بالحويصلات (V) مع كمية كينيسين الموجودة في الجزء القابل للذوبان (S) لخمسة شروط مختلفة. عندما تمت معالجة الحويصلات مسبقًا بـ 5 ملي مولار NEM ، كانت كمية كينيسين المنبعثة من الحويصلات بواسطة hsc70 غير المعالج (زوج VS 2) مماثلة لتلك التي شوهدت بدون hsc70 (زوج VS 1) أو مع NEM موجود أثناء حضانة hsc70 (زوج VS 3). في المقابل ، أظهر hsc70 المُعالج مسبقًا بـ 5 مم NEM (زوج VS 4) قدرة على إطلاق kinesin مقارنةً بقدرة hsc70 غير المعالجة (زوج VS 5). بالنسبة للمعالجة المسبقة مع NEM ، تم تحييد NEM غير المتفاعل عن طريق إضافة DTT الزائدة قبل الفحص. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM n = 3 تجارب ما لم ينص على خلاف ذلك.

تم تقييم أدوار الكاتيونات ثنائية التكافؤ والتحلل المائي لـ ATP في إطلاق kinesin المرتبط بالحويصلة بواسطة hsc70 لأن وظيفة hsc70 تتطلب تحللًا مائيًا معتمدًا على Mg ++ من ATP (Wilbanks وآخرون.، 1994). أدت إضافة الميلي مولار EDTA في حالة عدم إضافة Mg ++ المضافة إلى تقليل كمية كينيسين التي تم إطلاقها بواسطة hsc70 / ATP إلى 20 ٪ (الشكل 5 أ). كان هذا متسقًا مع الملاحظات التي تفيد بأن EDTA زادت من كمية كينيسين التي احتفظت بها أجهزة MBO أثناء التجانس (الشكل 3). في ظل ظروف الفحص ، لم تثبط EDTA تمامًا ، ربما نتيجة للكاتيونات ثنائية التكافؤ المتبقية الموجودة في جزء الحويصلة وإضافة ATP. تم تقليل كفاءة الإطلاق أيضًا عن طريق الحضانة باستخدام AMP-PNP أو الأدينوزين 5 ′ - [β ، γ- ميثيلين] ثلاثي الفوسفات ، وهما نظائران غير قابلين للتحلل من ATP. قلل كل من نظائر ATP من إطلاق kinesin بوساطة hsc70 من الحويصلات إلى -30 ٪ (الشكل 5 أ). لا يرتبط أي من هذه النظائر بإحكام بـ hsc70 ولكن يعمل كمثبطات تنافسية ضعيفة في وجود ATP المتبقية من كسور الحويصلة. تشير هذه النتائج معًا إلى أن الارتباط والتحلل المائي لـ MgATP مطلوبان من أجل إطلاق kinesin بوساطة hsc70 من MBOs.

كان إطلاق كينيسين المرتبط بالغشاء بواسطة hsc70 حساسًا أيضًا لـ NEM في المختبر (الشكل 5 ب). عندما تمت إضافة 2 ملي NEM و hsc70 في نفس الوقت (الوقت 0) ، تم حظر إطلاق kinesin بواسطة hsc70 بشكل فعال. تطلبت هذه الكتلة ألكلة السلفهيدريل بواسطة NEM لأن إضافة كميات مماثلة من NEM المعطل بواسطة DTT في الوقت 0 لم يكن لها أي تأثير على إطلاق كينيسين بواسطة hsc70. ومع ذلك ، أدت إضافة NEM إلى العينات في أوقات مختلفة بعد إضافة hsc70 إلى إنشاء دورة زمنية لإطلاق كينيسين (الشكل 5 ب). لم تؤثر إضافة NEM و gt 20 دقيقة بعد hsc70 على كمية كينيسين التي تم إطلاقها في مادة طافية ، ولكن نتج عن تناقص واضح في إطلاق كينيسين إذا تمت إضافة NEM بعد 10 دقائق من بدء حضانة hsc70. إذا تمت معالجة كسور الحويصلة بـ 5 ملي NEM وتم تحييد فائض NEM عن طريق إضافة DTT الزائدة قبل إضافة hsc70 ، لم يعد hsc70 قادرًا على إطلاق kinesin من كسور الحويصلة (الشكل 5 ب). في المقابل ، لم يكن للمعالجة المسبقة المماثلة لـ hsc70 مع NEM أي تأثير على قدرتها على إطلاق كينيسين من الحويصلات. وبالتالي ، يجب أن يكون المكون الحساس لـ NEM المطلوب لإصدار hsc70 من kinesin مكونًا مرتبطًا بـ MBO.

لتوصيف التفاعلات بين KLC و hsc70 بشكل أكبر ، تمت إضافة بروتينات الاندماج التي تحتوي على تركيبات KLC مختلفة إلى اختبار إطلاق كينيسين. تم استخدام أربعة بروتينات اندماج GST مختلفة معبرًا عنها جرثوميًا: 1) يحتوي GST-LCA على KLC A كامل الطول مدمج في GST 2) يحتوي GST-TR1 على أحماض أمينية متكررة ترادفية KLC 238-321 مدمجة في GST 3) يحتوي GST-TR2 على تكرار ترادفي لـ KLC الأحماض الأمينية 238-488 مدمجة في GST و 4) تم استخدام GST وحده كعنصر تحكم في هذه المقايسات. مثبط كل من GST-LCA و GST-TR1 و GST-TR2 إطلاق كينيسين بواسطة hsc70 ، لكن GST وحدها كانت غير فعالة (الشكل 6 أ). كان GST-TR1 و GST-TR2 أكثر فعالية من GST-LCA في تثبيط إطلاق كينيسين بواسطة hsc70 (الشكل 6 أ). أثارت الاختلافات في درجة التثبيط بين GST-LCA و GST-TR1 / TR2 إمكانية التعاون السلبي بين التكرارات الترادفية ومجالات KLC الأخرى. عندما تم اختبار قدرات GST-LCA و GST-TR1 لمنع إطلاق كينيسين بنسب مولارية مختلفة (الشكل 6 ب) ، اقترب كل من GST-LCA و GST-TR1 من التشبع بنسبة جزيئية 1: 1 إلى hsc70. ومع ذلك ، كان GST-TR1 أكثر فعالية في تثبيط إطلاق كينيسين من GST-LCA في جميع النسب المولية. لم تقلل GST-LCA مطلقًا من إطلاق كينيسين بواسطة hsc70 إلى أقل من نصف الحد الأقصى ، في حين أن GST-TR1 منع إطلاق كينيسين بوساطة hsc70 تقريبًا.

الشكل 6. بروتينات الانصهار المحتوية على KLC أو KLC المتكررات الترادفية تمنع قدرة hsc70 على إطلاق كينيسين من الحويصلات. (أ) تم اختبار إطلاق كينيسين بوساطة Hsc70 من كسور حويصلة V2 كما هو موضح أعلاه. تم إنشاء أربعة تركيبات مختلفة: GST و GST-LCA و GST-TR1 و GST-TR2. عند نسبة مولارية 1: 1 لبروتين الانصهار: تمنع تركيبات hsc70 و GST-LCA و GST-TR1 و GST-TR2 إطلاق كينيسين بواسطة hsc70. في المقابل ، كانت ضريبة السلع والخدمات (GST) وحدها غير نشطة في هذه المقايسات. كانت التركيبات التي تحتوي على مجالات تكرار ترادفية KLC فقط (TR1 و TR2) أكثر فعالية من تلك التي تحتوي أيضًا على مجالات KLC أخرى (GST-LCA). يختلف KLC المؤتلف وبروتينات الانصهار المتكرر الترادفي في فعاليتهما النسبية لتثبيط إطلاق kinesin بوساطة hsc70. (ب) قد تعكس القدرة الأقل لـ GST-LCA على تثبيط الإطلاق بوساطة hsc70 بالنسبة إلى GST-TR1 / TR2 الاختلافات في كمية البروتين النشط أو تأثير المجالات في KLC بخلاف التكرارات الترادفية. إذا اختلفت كمية البروتين النشط ، فيجب أن تقلل النسب المولية المتزايدة من KLC إلى hsc70 الفروق الملحوظة. ومع ذلك ، في جميع النسب المولية التي تم اختبارها ، كان GST-TR1 أكثر فعالية في تثبيط إطلاق كينيسين بواسطة hsc70 مقارنة بـ GST-LCA. يبدو أن تأثيرات GST-LCA تستقر عند 30٪. (ج) لتحديد ما إذا كان GST-LCA و GST-TR1 يختلفان في تفاعلهما مع hsc70 ، تم تقييم قدرة التركيبات المختلفة على تنشيط نشاط hsc70 ATPase. حفز كل من GST-LCA و GST-TR1 نشاط hsc70 ATPase إلى حد مماثل ، مما يشير إلى قدرة مماثلة على ربط وتفعيل hsc70 ATPase. كانت ضريبة السلع والخدمات وحدها غير نشطة. لذلك ، فإن الاختلافات في قدرة بروتينات الاندماج LCA و TR1 على تثبيط إطلاق kinesin بوساطة hsc70 من الحويصلات لم تكن بسبب الاختلافات في قدرتها على التفاعل مع hsc70 ، لذلك يجب أن تؤثر مجالات KLC خارج التكرارات الترادفية على قدرة hsc70 على الإطلاق. kinesin من MBOs. تمثل أشرطة الخطأ ± SEM n = 3 تجارب ما لم ينص على خلاف ذلك.

الاختلافات المطابقة بين GST-LCA و GST-TR1 / TR2 التي أثرت على التفاعلات مع hsc70 يمكن أن تفسر هذا الاختلاف أيضًا. يمكن تقييم قدرة المجال J على ربط hsc70 عن طريق فحص تحفيز نشاط hsc70 ATPase (Cyrوآخرون.، 1994 Tsai and Douglas، 1996 Greene وآخرون.، 1998). كانت GST وحدها غير نشطة في فحوصات hsc70 ATPase ، لكن كلا من GST-LCA و GST-TR1 حفز نشاط hsc70 ATPase إلى حد مماثل (الشكل 6 ج). يشير هذا إلى أن التكرارات الترادفية وبروتينات اندماج KLC كاملة الطول كانت قابلة للمقارنة في قدرتها على ربط وتفعيل hsc70 ATPase. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن أشكال KLC J-domain تتفاعل مباشرة مع hsc70. قد تعكس الاختلافات بين KLC وتثبيط مجال التكرار الترادفي لإطلاق كينيسين بوساطة hsc70 من الحويصلات تفاعل المجالات الأخرى في KLC مع مكونات الغشاء.

أخيرًا ، تم فحص قدرة hsc70 الخارجية على إطلاق كينيسين من الأغشية في الموقع (الشكل 7). تم نفاذية الخلايا عن طريق الحضانة بنسبة 0.01٪ Triton X-100 لمدة 4 دقائق في وجود أو عدم وجود hsc70 خارجي قبل التثبيت. أنتجت حضانة قصيرة مع hsc70 انخفاضًا ثابتًا في نشاط مناعة كينيسين (الشكل 7 ، أ و ب). تأثرت فعالية كينيسين المناعية في العمليات بشدة ، ولكن كان هناك أيضًا استنفاد للكينيسين في أجسام الخلايا بالنسبة لخلايا التحكم. حقيقة أنه لم يتم استخلاص كل الكينيسين عن طريق حضانة hsc70 القصيرة تتوافق مع الدراسات البيوكيميائية (انظر الشكل 5) ولكنها قد تمثل أيضًا إما جزءًا من كينيسين مقاوم لإطلاق hsc70 أو يتطلب عاملًا مساعدًا إضافيًا غير محفوظ في ظل هذه شروط.

التين. 7. خارجي المنشأ hsc70 يطلق كينيسين من خلايا نفاذية بلطف. يظهر التألق المناعي Kinesin في الخلايا غير المعالجة (A و B) والخلايا المعالجة بـ hsc70 (C و D). تم الحصول على الصور A و C بـ 40 × ، وتم الحصول على الهدف و B و D باستخدام قضبان معايرة موضوعية 63 × تبلغ 20 ميكرومتر في كل حالة. تم تكبير العناصر الداخلية في B و D رقميًا (4 ×) من المناطق المحددة بواسطة الصناديق السوداء. انخفض نشاط الجهاز المناعي Kinesin بعد علاج HSC70. بمقارنة A و C ، يتم تقليل كمية كينيسين في العمليات وفي الهالة المحيطة بالنواة. بمقارنة B و D ، فإن تآكل نشاط مناعة كينيسين في الهالة المحيطة بالنووية يكون أكثر سهولة. يكون التأثير أكثر وضوحًا بالقرب من مركز الخلية (B و D ، داخليان) ، حيث يتم تقليل كثافة الهياكل المتقطعة ، مما ينتج عنه بقعة أرق حول النواة. ستؤدي العلاجات الأطول إلى إزالة المزيد من نشاط مناعة كينيسين.


يكفي ناقل غلوتامات حويصلي واحد لملء حويصلة متشابكة

الحجم الكمي هو استجابة ما بعد المشبكي لإطلاق حويصلة متشابكة واحدة ويتم تحديده جزئيًا بواسطة كمية المرسل داخل تلك الحويصلة. في المشابك الجلوتاماتيكية ، يملأ ناقل الغلوتامات الحويصلي (VGLUT) الحويصلات بالغلوتامات. بينما يزيد تعبير VGLUT المرتفع من الحجم الكمي ، فإن الحد الأدنى لعدد الناقلات المطلوبة لملء الحويصلة غير معروف. في طفرات Drosophila DVGLUT ، يؤدي انخفاض مستويات النقل إلى انخفاض يعتمد على الجرعة في وتيرة الإطلاق الكمي التلقائي دون تغيير في الحجم الكمي. لا يقتصر التردد الكمي على عدد الحويصلات أو خلل في إفراز الخلايا. يشير هذا إلى أن وحدة وظيفية واحدة للناقل ضرورية وكافية لملء الحويصلة حتى اكتمالها وأن الحويصلات التي لا تحتوي على DVGLUT فارغة. تمشيا مع وجود حويصلات فارغة ، تكون الحويصلات المشبكية في dvglut المتحولة أصغر حجمًا ، مما يشير إلى أن ملء الحويصلة و / أو مستوى الناقل هو محدد مهم لحجم الحويصلة.

الأرقام

الشكل 1. مستويات البروتين DVGLUT وتلطيخ ...

الشكل 1. يتم تقليل مستويات البروتين والتلوين DVGLUT في dvglut المسوخ

الشكل 2. تردد mEJP لكن ليس mEJP ...

الشكل 2. تم تقليل تردد mEJP ولكن ليس سعة mEJP في dvglut المسوخ

الشكل 3. لم يتم اكتشاف أحداث عفوية ...

الشكل 3. لم يتم الكشف عن أحداث عفوية في dvglut المسوخ الفارغ على الرغم من الاستجابات الطبيعية للغلوتامات

الشكل 4. الحويصلات المتشابكة وفيرة ولكن ...

الشكل 4. الحويصلات المتشابكة وفيرة ولكنها أصغر في المتوسط dvglut المسوخ

الشكل 5. تجمع الحويصلة الهوائية دون تغيير ...

الشكل 5. تجمع الحويصلة الدائرية لم يتغير فيه dvglut Hypomorphs ، على الرغم من انخفاض سعة EJP


شاهد الفيديو: المحاضرة الثامنة. النقل النشطالبلعمةالشرب الخلويالاخراج الخلوي. الفصل الأول (كانون الثاني 2022).